模式动物篇基于小鼠的干细胞研究

介绍

干细胞（SC）的定义如下，它们在未分化的状态下具备自我更新的能力，同时还具备在体外或体内条件下分化成为多种成熟体细胞的潜能。根据它们所能形成的成熟细胞的类型干细胞可以分为四种类别:胚胎干细胞（ESCs）具备全能性，它们能够分化为所有的体细胞类型[3]。诱导性全能干细胞（iPS）是经过重编程而具备了全能性状态的体细胞，它们被认为与胚胎干细胞有着相同的“干性”因子[4]。而成体干细胞（ASCs）比如造血干细胞（HSCs）在分化潜能上通常限定于它们所来源的器官[5]。最后一类是癌症中的某些细胞，它们具备与干细胞类似的特性并表达类似的标记物：这些细胞（癌干细胞（CSCs））可能促进了肿瘤的发生。

干细胞在治疗人类疾病方面有着很大的潜力因此众多研究集中在干细胞研究领域。而小鼠是干细胞生物学研究的主要模型,这使得它们在推动我们对干细胞潜在的治疗应用的认识方面显得极为重要。

小鼠胚胎干细胞（mESCs）

分离与培养

在利用畸形瘤获得了经验之后,两个研究组在年独立分离和培养了首例小鼠胚胎干细胞[6,7]。胚胎干细胞是由胚胎中失去全能性并具备特定细胞命运之前的内细胞团（ICM）组成。胚胎干细胞是目前研究最多的干细胞,而大量的研究是在小鼠中进行。尽管胚胎干细胞分离的效率似乎具有种属依赖性,小鼠胚胎干细胞是通过相对直接的方式获取的:小鼠囊胚（e3.5）从母鼠的子宫角中取出，透明带用0.5ml酸性台氏液溶解。然后将剥离了透明带的囊胚在丝裂霉素C失活（或是辐射失活）处理的融合性小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）组成的滋养细胞层上培养数天，这些滋养层细胞在使用前已经预培养数小时（或过夜）。之后囊胚会进入贴壁状态，贴壁后滋养层细胞和内胚层细胞开始分裂。一旦内胚层细胞生长到囊胚大小的3-4倍，这些细胞便被挑选出来,用胰蛋白酶/EDTA小心的处理并吹散,之后重新铺板（图1）。在合适的条件下分离出的内胚层细胞约有1%会继续分裂并维持未分化的胚胎干细胞形态。滋养层细胞（MEFs）提供的营养因子包括白血病抑制因子（LIF）和骨形态发生蛋白4（BMP-4）以及其它因子.除了MEFs分泌的因子，大多数细胞系还需要在培养基中补充这些因子，它们帮助细胞维持未分化的自我更新状态。尽管在MEF滋养层细胞上培养干细胞是标准的和更为传统的操作步骤,现在已经有不同的操作步骤能够成功的获得和维持未分化的mESCs生长。某些mESCs能够在没有MEF滋养层细胞的状态下生长，不过许多细胞会很快的分化虽然培养基中含有LIF。无MEF培养法主要通过如下方式取代滋养层，在培养mESCs之前用0.1%明胶包被培养板30分钟[8]。其他的方法包括使用条件性培养基[9]以及细胞因子和不同抑制剂的使用[10,11]。除了上述的外源性因子维持mESC自我更新能力的还有特定的转录网络。这种转录网络包含有Oct4,Nanog和Sox2，每种因子都会促进自身和彼此的表达从而构成正反馈回路[12]。

图1.从ICM细胞中培养ESC。

mESC细胞系的特征和转基因

一旦mESCs被成功分离并且相关的细胞系也得以建立之后,这些细胞的特征需要加以分析.有很多种方法可以分析细胞特征，比如核型分析,拟胚体和小鼠嵌合体。这些细胞需要经过核型分析以确保它们是整倍体，它们的全能性可以通过体外和在体的多种方式加以验证。在悬浮培养的条件下ES细胞具有形成类似胚胎的细胞聚集体的能力，这种聚集体由三胚层来源的细胞组成（内胚层，中胚层和外胚层），通常被称作拟胚体[13]。为进行在体验证,mESCs被注射进免疫缺陷的小鼠体内，它们有形成畸胎瘤的能力，而畸胎瘤中包含起源于三个胚层的各种组织。向正常的囊胚中注射mESCs可以得到嵌合体小鼠，在包括生殖细胞在内的所有器官中都会有外来mESCs来源的细胞，这表明mESCs具备形成成体动物所有器官的潜能[14]。现在已经有多家商业机构可以帮助学术机构进行相关的检验。

小鼠ES细胞最常见的一种应用是通过将外源的DNA注射进入ES细胞进行基因改造以获得小鼠模型.目前有多种方式可以实现向ES细胞的基因传递如病毒和非病毒途径。病毒传递时我们会使用病毒基因组做载体（比如腺病毒和慢病毒）,载体中携带有目标基因，进入干细胞中会开始表达.非病毒途径更为常见这包括电穿孔转染，脂质体转染以及细胞核转染技术。改造后的ES细胞可以用于上文提到的嵌合体小鼠的构建。

图2.基态多能干细胞和初态多能干细胞的起源和特性.源自[1]。

可用的mESC细胞系

目前有来源于不同小鼠品系的多种mES细胞系可用，它们经过遗传改造后已被用于构建多种疾病的小鼠模型，当然很明显的一点是ES细胞的遗传背景对特定的疾病模型很重要。当比较ES细胞系中靶向基因所引起的表型时，不同遗传背景所引起的差异可能会凸显出来。因此在特定领域的研究中仔细选择细胞系便显得很重要[15]。在疾病相关的研究中与遗传背景相关的各种问题是使用其他类型干细胞如iPS细胞进行研究的重要推动力（如下）。

TheJacksonLaboratory有多种商业化的ES细胞系可供学术机构选择。此外,Invitrogen也提供特定启动子驱动的稳定表达GFP的mES细胞系。表达GFP的ES细胞系在移植和组织替换的研究中非常有用。最新的研究中可诱导表达特定转录因子（TFs）的mES细胞系已经被制备出来。这些细胞系中所改造的转录因子的选择依据是它们与mES细胞关键的功能以及细胞分化相关如Sox2,Sox9和Nanog。TF改造的ES细胞系可用于研究ES细胞向特定细胞谱系分化的复杂机制[16]。国家老化研究院提供有这一研究中构建的目前可用的转基因ES细胞系的详细列表。

mESCs的局限性

mESCs的制备和使用是有一定局限性的。很不幸的一点是并非所有的小鼠品系都有成熟的ES细胞系:只有从有限的几种小鼠品系如,C57BL/6和BALB/C中能够成功的分离得到mESC。这使得在其它品系中研究基因的功能和疾病的发生变得困难.因此研究中需要考虑到ES细胞理论在物种间的适用性。

小鼠上胚层干细胞-mEpiSCs

另一种类型的全能细胞分离自小鼠的上胚层，这是胚胎植入后起源于ICM的单层上皮细胞（图2）。这些细胞（mEpiSCs）与mESCs在分子和表观遗传学特性上并不相同，因此分别被称为初态干细胞和基态干细胞[17]；尽管mEpiSCs具备全能性，不过与mESCs相比它们的发育潜能更为局限。这一新发现为这类细胞在研究中的应用提供了新的见解，因为与mES细胞相比，mEpiSCs与人的ES细胞更为类似。它们与hESCs有着相似的特性比如平面二维（2D）的克隆形态，它们也在相似的生长因子条件下培养。mEpiSCs与人类ES细胞间的这种相似性意味着它们有着功能上的相似性。mEpiSCs与mESCs一样能够表达Oct4,Sox2和Nanog并在体外分化和在体畸胎瘤形成时能形成所有三个胚层起源的细胞和组织。然而在注射入受体的囊胚后它们不能形成嵌合体，此外mESCs生长需要LIF和BMP4,mEpiSC和hESCs生长需要bFGF,ActivinA,或是TGF尾的混合物以及Wnt信号通路的活化[18]。

诱导多能干细胞（iPS）

小鼠中的体细胞核移植

50多年前从青蛙开始，通过实验方式改变细胞命运已经进行了多年。当一个体细胞的细胞核被移植进卵子替代卵细胞的细胞核,体细胞原有的命运被移除并随卵细胞获得了胚胎或是多能性的状态。这种从分化状态逆转为多能性状态的方法便是体细胞核移植（SCNT）。多年来这是获得治疗用的病人特异性细胞系的主要技术手段。利用SCNT得到的多能干细胞基因完全相同因此将分化后的细胞移植回患者体内后不受免疫排斥影响因而是一项受人







































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