CancerResearch多组学

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『脂肪细胞诱导的FABP4表达促进卵巢癌细胞迁移和介导其对卡铂的耐药性』

●期刊：CancerResearch

●IF=9.

●发表时间：-02-13

腹膜转移是上皮性卵巢癌（OvCa）的特征，转移的主要部位是网膜，网膜是一种荷尔蒙活跃的脂肪垫，可以保护大小肠。虽然OvCa的来源尚不确定，但有越来越多的证据表明，源自输卵管远端或卵巢表面上皮的细胞会经历上皮-间质转化（EMT），分离并在腹腔中扩散。网膜的主要细胞类型脂肪细胞在维持其组织结构和内分泌功能中起着至关重要的作用。一旦癌细胞转移至网膜，它们就会对网膜脂肪细胞释放脂解信号，从而促使后者释放长链脂肪酸。随后，癌细胞通过CD36受体吸收来自脂肪细胞的脂质。因此，脂肪细胞对于卵巢癌（OvCa）细胞转移并归巢到网膜至关重要，但是由这种相互作用引发的代谢变化尚不清楚。

作者对原代人网膜脂肪细胞共培养的癌细胞进行了基于质谱的代谢组学和蛋白质组学分析，观察癌细胞蛋白质组代谢组改变，尤其是脂质组的变化及脂质代谢相关蛋白的改变。FABP4作为一种脂质伴侣蛋白，被确定为与脂肪细胞共培养的OvCa细胞中脂质反应的关键调节蛋白。随后，作者对FABP4knock-down，观察DNA5-羟甲基胞嘧啶水平，OvCa转移相关的基因标志物及克隆性癌细胞的存活率。此外，作者观察CRISPR介导的FABPknock-out的浆液性OvCa细胞对小鼠的转移性肿瘤负担的影响。另外，作者验证FABP4的小分子抑制剂（BMS）是否能显著降低同基因型小鼠模型中的肿瘤负担，及观察癌细胞在体外和体内对卡铂的敏感性。

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代谢组学分析脂肪细胞对卵巢癌细胞脂代谢的影响

作者进行了非靶向代谢组学研究，以了解人原代网膜脂肪细胞（HPA）对卵巢癌细胞代谢组的影响。将OvCa细胞与HPA分别共培养4和18小时，以确定早期和晚期代谢改变。作者对与HPA共培养的癌细胞脂质组研究表明，癌细胞会积累数种短链和长链脂肪酸，其中亚油酸（18：2）含量最高（A），并且在4小时和18小时均升高。共培养的癌细胞还表现出氧化应激特征，其表现为棕榈酸酯，硬脂酸酯，胆固醇和脂蛋白（例如13-HODE和9-HODE）的羟基种类增加（B）。另外，OvCa细胞与脂肪细胞共培养时，对细胞内活性氧（ROS）和脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的诱导表现出时间依赖性（C，D）。在细胞培养中观察到的脂质过氧化产物的增加在4例HGSOC网膜转移患者中证实。网膜脂肪细胞附近的癌细胞显示出，脂质过氧化的替代物抗4-羟基壬烯醛（4-HNE）加合物表达增加（E）。

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蛋白质组学分析脂肪细胞共培养对卵巢癌细胞中脂代谢相关蛋白的影响

为了分析调节脂肪细胞共培养后癌细胞中代谢变化的蛋白质，作者在相同的培养条件下进行了基于质谱的蛋白质组分析。基于早期检测到细胞内脂质变化，因此作者将SKOV3ip1细胞与脂肪细胞共培养4小时，并分析了蛋白质组。其中，FABP4，CD36和乙醇脱氢酶（ADH）1蛋白表达增加（A）。ADH1B调节乙醇代谢，对卵巢癌的发展具有预后意义。人网膜HGSOC转移样本的免疫组化结果显示，ADH1B，CD36和FABP4在上皮肿瘤中表达升高（B）。基于代谢组学分析的主要是脂质组学变化，作者重点分析CD36和FABP4。通过Westernblot结果验证，与脂肪细胞共培养后，SKOV3ip1细胞中CD36和FABP4蛋白表达增加（C）。此外，作者发现敲除CD36可降低脂肪细胞诱导的FABP4表达（D），而敲除FABP4并不影响脂肪细胞介导的CD36表达（E）。因此，数据表明这两种蛋白之间存在功能或调节联系，其中CD36是FABP4的上游调控蛋白。

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对FABP4参与脂代谢调控作用分析

前期研究结果显示，CD36在癌细胞中的脂肪细胞介导的脂质摄取中起作用。作者对与脂肪细胞共培养的OvCa细胞中FABP4稳定敲低，随后做非靶向代谢组学检测，揭示了癌细胞脂质组的重大变化（3A）。因为中性脂质被癌细胞氧化（3,27），作者检测了脂肪酸的氧化作用，发现FABP4的缺失减少了癌细胞中脂肪细胞诱导的非组成型的氧化（3B）。FABP4的表达抑制还可以阻止脂肪细胞诱导的ROS生成（3C）和脂质过氧化（3D）。由于氧化和ROS是细胞增殖的已知驱动力，因此作者后续分析它们在脂肪细胞诱导的细胞增殖中的作用。使用N-乙酰半胱氨酸（ROS螯合剂）和依托莫昔（CPT1和β-氧化抑制剂)，我们发现β-氧化和ROS均对脂肪细胞诱导的细胞增殖有促进作用（3E）。

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分析FABP4表达抑制对DNA甲基化水平的影响

代谢组学数据表明，在脂肪细胞共培养作用下，FABP4调节的TCA循环代谢物是柠檬酸，异柠檬酸，α-酮戊二酸和苹果酸（4A）。在细胞内谷氨酰胺/谷氨酸水平上没有检测到显著变化（4A），从而说明FABP4在葡萄糖氧化中的作用。FABP4过表达增加了线粒体氧化，而糖酵解速率未见变化（4B，C）。在相反的实验中，FABP4表达抑制降低了线粒体的氧化，并伴随着糖酵解速率的增加（4D，E）。抑制FABP4表达导致糖酵解来源的ATP产生增加，线粒体ATP产生减少（4F）。但是，总的ATP产量保持不变（4F）。这表明当FABP4表达被抑制时糖酵解会补偿性增加。由于α-酮戊二酸是FABP4-knockdown细胞中被诱导发生变化最大的TCA循环中间产物，因此作者重点验证其对癌细胞的作用。α-酮戊二酸是TET酶的共同底物，该酶将DNA5-甲基胞嘧啶氧化为5-羟甲基胞嘧啶（5-hmc），从而调节DNA甲基化并减少细胞增殖。与这些结果一致，FABP4-knockdownSKOV3ip1细胞与脂肪细胞共培养，显示在细胞周期的G1期5-hmc水平升高（4G，H）。

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分析验证FABP4对卵巢癌细胞的增殖与转移的调控作用

为了确定抑制FABP4对基因表达的影响，作者对从稳定转导FABP4shRNA的细胞中分离到RNA进行了微阵列分析。FABP4的表达抑制改变了个基因的表达，其中个基因被上调，而73个基因被下调。IPA分析显示knockdownFABP4抑制了肿瘤细胞增殖，迁移和侵袭。与IPA分析一致，FABP4-knockdown细胞在克隆形成实验中显示出菌落形成能力下降（5B）。与CRISPR对照组相比，腹腔注射FABP4CRISPR细胞克隆的动物转移植入物更少（n=51.8vsn=.7）和更小的肿瘤（mgvsmg）（5C）。与转导shRNAFABP4结果一致（4H），我们观察到用脂肪细胞条件培养基处理的FABP4CRISPR细胞的DNA中5-hmc水平增加。体外实验数据说明，FABP4CRISPR细胞产生的网膜转移肿瘤具有更强的5hmc染色（5D）

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分析验证FABP4小分子抑制剂对卵巢癌细胞的增殖及网膜归巢抑制作用

考虑到使用shRNA和CRISPR抑制FABP4对OvCa增殖和转移的影响，作者用小分子抑制剂对结果进行再次验证。最后得到验证的结果与上述实验结果一致。

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分析验证抑制FABP4能增强卵巢癌细胞对卡铂的敏感性

作者基于BMS对卵巢癌细胞转移的抑制作用，验证其与卡铂联合使用的疗效。在细胞系实验与动物实验中，均显示BMS能增强卵巢癌细胞对卡铂的敏感性，证明抑制FABP4能增强卵巢癌细胞对卡铂的敏感性

●脂肪细胞能重塑卵巢癌细胞的代谢

●FABP4作为脂代谢重要调控蛋白，其抑制能减弱卵巢癌细胞的转移能力及增强其对卡铂的敏感性，其可以作为潜在的治疗靶点进行深入研究

●DNA的甲基化水平与脂代谢有潜在的关联性

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