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1.通讯作者：GeetanjaliSharma；新墨西哥大学综合癌症中心

2.摘要：

人类肥胖已成为一种全球健康流行病，目前几乎没有安全有效的药物疗法。绝经后女性卵巢雌二醇(E2)的全身性丧失大大增加了肥胖和代谢功能障碍的风险，揭示了E2在这种情况下的关键作用。E2的有益作用传统上归因于经典的雌激素受体ER的抑制和ER的乙酰化，而G蛋白偶联雌激素受体(GPER)的贡献仍然很大程度上未知。在这里，我们使用卵巢切除和饮食诱导肥胖(DIO)小鼠模型来评估GPER选择性小分子激动剂G-1(也称为Tespria)对抗肥胖和代谢功能障碍的临床前活性。G-1对去卵巢的雌性小鼠(绝经后肥胖模型)的治疗在不改变食物摄入量、燃料来源使用或运动活动的情况下减轻了体重并改善了葡萄糖稳态。接受g-1治疗的雌性小鼠也表现出能量消耗增加、体脂肪含量降低、空腹胆固醇、葡萄糖、胰岛素和炎症指标降低，但未表现出子宫女性化效应(吸胀)或对骨骼健康有益的作用。G-1对DIO雄性小鼠的治疗并没有导致体重下降，而是阻止了体重的进一步增加，并提高了葡萄糖耐量，这表明G-1改善葡萄糖稳态的作用独立于其抗肥胖的作用。然而，在去卵巢的DIO雌鼠中，G-1继续导致体重减轻，这反映了G-1作用机制中可能存在的性别差异。总之，这项工作表明，在多种临床前男女模型中，选择性激动剂是一种可行的治疗肥胖症、糖尿病和相关代谢异常的方法。

3.背景及意义：

饮食及生活方式和环境因素是造成全球肥胖流行的原因。到目前为止，很少有疗法能成功地对抗或逆转肥胖，大多数是通过中枢神经系统通过食欲来调节饱腹感或饱腹感。目前现有的减肥药多半有意外的毒性及不良的副作用。因此,必须确定目标,途径,以及治疗肥胖及其相关并发症的药物种类。

女性主要雌激素雌二醇(E2)通过不同的分子和细胞途径对代谢和心血管生理发挥性别二态保护作用，与同龄男性相比，预防绝经前女性内脏肥胖、高脂血症、胰岛素抵抗、炎症和高血压。因此，由于雌激素保护功能的丧失，绝经后妇女表现出对体重增加和相关代谢功能障碍的敏感性增加，而这可以通过补充E2来改善。E2的代谢效应很大程度上归因于核雌激素受体的抗雌激素受体和抗雌激素受体，它们通常作为配体激活的转录因子发挥作用，尽管E2的快速信号反应已被认为是整个雌激素活性的关键。从遗传学和药理学的角度来看，越来越多的证据表明，G蛋白诱导的雌激素受体(GPER，以前称为GPR30)在E2的作用中发挥着重要的作用，特别是在代谢调节、心血管功能和癌症方面。

我们之前的研究表明，雄性GPER敲除(KO)小鼠概括了代谢综合征的许多方面，包括肥胖、性腺脂肪垫质量增加、血脂异常、胰岛素抵抗、葡萄糖耐受不良和炎症。雄性GPERKO小鼠比雌性GPERKO小鼠更早增重，尽管雄性和雌性GPERKO小鼠都表现出能量消耗和棕色脂肪中热基因表达的显著减少。此外，与同基因野生型(WT)小鼠相比，雌性GPERKO小鼠对瘦素和胆囊收缩素的厌食作用较不敏感，而补充E2摘除卵巢(OVX)GPERKO小鼠并没有减轻体重。总之，这些结果证明E2可能通过已知的和可能还不为人知的gper介导机制来调节体重和代谢。

在这项研究中，我们报告了体内选择性活化GPER的代谢效应和治疗益处。我们使用了OVX雌性小鼠作为绝经后E2缺失的模型，并在雄性和OVX雌性小鼠中使用了饮食诱导肥胖(DIO)，所有这些小鼠都表现出体重增加和代谢功能障碍。由于E2非选择性地结合到所有三个受体(内质网受体、内质网蛋白受体和GPER)上，我们通过使用GPER唯一已知的高选择性小分子(MW.3Da)激动剂G-1(以下称为G-1)选择性地激活了GPER。我们的结果显示G-1激活GPER可能代表了一种转化方法，作为一种先导原型剂，可用于治疗人类肥胖和代谢综合征，尤其是糖尿病，对绝经后女性和男性也适用。

4.结果：

（1）GPER的激活可以减少因雌激素缺乏而导致的肥胖

为确定在E2缺乏的小鼠中激活GPER是否可以减轻肥胖和代谢功能障碍的症状，我们使用了一种OVX小鼠模型——双侧手术摘除卵巢导致内源性E2的显著丢失，从而导致多方面的代谢功能障碍。在我们的研究中，雌性小鼠在10周龄时(平均体重22.51.6g)为OVX，允许在接下来的12周内随意喂食正常鼠粮(NC)。此时，卵巢完整组和OVX组小鼠的平均体重差异为5.3g，在OVX组中增加了约18%的体重(图1A)。

此外，OVX小鼠还表现出葡萄糖稳态受损，表现为基线血糖升高，葡萄糖和胰岛素耐量受损。随后，OVX小鼠被随机分成两组，分别接受GPER选择性激动剂G-1或vehicle治疗6周，并与年龄匹配的卵巢完整小鼠组进行比较。在为期6周的G-1治疗期间，每周测量体重。卵巢完整小鼠的体重略有增加，，而药物处理OVX小鼠的体重没有任何可检测到的变化。相比之下，给予OVX小鼠g-1治疗后，体重出现进步性下降，并在治疗2周后首次出现，此后，接受G-1治疗的小鼠体重持续下降，在治疗4周后，它们的体重与卵巢完好的小鼠相似。

在治疗结束后对肾周脂肪垫的解剖显示，G-1降低了OVX小鼠中两个脂肪垫的湿重。由于肥胖导致血脂异常，我们还分析了空腹循环血浆脂类，结果显示，卵巢切除增加了小鼠的总胆固醇，G-1治疗显著降低了OVX小鼠的胆固醇浓度至卵巢完整对照组小鼠的水平。然而，甘油三酯在任何治疗组之间没有统计学差异。由于已知E2治疗可促进OVX小鼠的子宫营养活动，如湿重增加，因此也测定了子宫的湿重。正如预期的那样，卵巢切除术导致子宫湿重显著下降;然而，与对照组相比，G-1治疗对子宫湿重没有影响。说明G-1治疗不会促进E2治疗导致的典型女性化生殖效应。

DEXA和MRI证实OVX小鼠身体脂肪含量显著增加,G-1治疗大大降低总体脂肪量。用扫描显示下半身脂肪含量和体脂百分比，发现与OVX小鼠比较，在G-1处理后的OVX小鼠，发现骨矿物质密度或骨矿物质含量没有任何变化。然而，与对照剂或G-1处理的OVX组相比，卵巢完整小鼠具有更高的骨密度和骨矿含量，这表明G-1在预防骨质流失方面并不有效，因此与E2不同。此外，MRI图像显示,OVX增加了整体腹部脂肪和皮下脂肪，而G-1处理导致两种脂肪库的脂肪减少，数量接近卵巢完好小鼠。

（2）在G-1治疗后，OVX小鼠表现出能量消耗增加

在G-1治疗中观察到的体重下降和脂肪积累减少可能是由于热量摄入减少或能量消耗增加，而这本身可能是基础代谢率提高或运动能力增强的结果。为了区分这些可能性，研究人员将小鼠置于代谢笼中，测量它们的食物摄入量、能量消耗(以VO2衡量)和呼吸交换比率[RER]。与卵巢完好的小鼠相比，空载处理的OVX小鼠在光周期和暗周期中均表现出能量消耗、RER和运动活动显著减少，但对食物摄入量没有明显影响。然而，与对照剂处理的小鼠相比，G-1处理的去卵巢小鼠在光照和黑暗周期中均显示出能量消耗增加，但RER没有变化，表明能量来源是碳水化合物和脂肪的混合。相反，在黑暗周期中，卵巢完整小鼠的RER接近1，表明碳水化合物是主要的能量来源。此外，与车辆控制相比，G-1对去卵巢小鼠的食物摄取量或运动活动没有影响。综上所述，这些结果表明，G-1治疗通过将脂肪作为主要能量来源增加了能量消耗，而对食物摄入量或运动活动没有影响。

（3）G-1治疗后OVX小鼠脂肪组织重塑

OVX小鼠经G-1治疗后表现为肥胖得到缓解以及能量消耗的增加，说明GPER激动剂可能通过调节脂肪组织发挥作用。在肥胖期间，脂肪组织经历明显的代谢和功能变化，包括脂肪细胞的增大，缺氧，炎症，以及糖和脂代谢的变化。空载OVX小鼠仅表现出增加整个脂肪垫以及单个脂肪细胞的大小。G-1治疗后减少了单个脂肪细胞的大小，表明增强脂肪组织的代谢。

由于肥胖通过调节参与缺氧和血管生成的关键基因的表达而导致脂肪组织扩张。因此，我们研究了G-1治疗是否调节了脂肪功能多个方面相关基因的表达。代表基因有Ppargc1a，Acox1，Hif1a，Vegfa。结果表明OVX增加了血管生成基因(Hif1a和Vegfa)的表达，同时降低了与周围脂肪垫氧化代谢相关的基因(Ppargc1a和Acox1)的表达，而G-1处理后使这些改变的基因表达模式正常化。我们还分析了蝙蝠解偶联蛋白(Ucp1)的基因表达，该蛋白与蝙蝠的产热能力有关。OVX显著降低了Ucp1的表达，而G-1处理恢复了其表达。蝙蝠的生热作用也受中枢神经系统的支配。为了测试G-1是否可能通过间接机制作用于BAT，我们量化了酪氨酸羟化酶(Th)的基因表达，Th是去甲肾上腺素合成中的限速酶，因此是交感神经支配的标志。与卵巢完整小鼠或经溶剂处理的OVX小鼠相比，G-1处理的OVX小鼠的BAT中Th表达更高。总之，这些结果表明，激活GPER以增加BAT生热作用，从而增加能量消耗，最终增强WAT分解代谢，降低体重。

（4）G-1处理上调线粒体基因表达和增加细胞呼吸

由于我们观察到G-1治疗后小鼠的全身能量消耗增加，我们检测了代谢重要组织中线粒体基因的表达。我们的结果显示，在G-1处理OVX小鼠后，Ppargc1a及其下游靶标乙酰辅酶A羧化酶(Acaca)、核呼吸因子(Nrf1)和转录因子A线粒体(Tfam)的表达增加。这些线粒体基因调节氧化代谢，维持糖脂稳态和能量平衡。同样，在G-1处理的小鼠骨骼肌中，Acaca、Nrf1、Tfam和Acox1的基因表达也上调。

为了进一步测试G-1是否会导致细胞代谢的增加，我们在体外对脂肪细胞的耗氧量进行检测。G-1刺激GPER24小时后可导致较高的基础耗氧率(OCR)，并在线粒体解偶联剂FCCP的作用下增加最大细胞呼吸。抑制ATP合成的寡霉素和阻断所有电子传递的鱼藤酮/抗霉素A的耗氧量在两个基团中是相似的。在G-1处理后基础耗氧率及最大呼吸量都增加了。提示GPER的刺激在体外增强了棕色前脂肪细胞的线粒体功能。综上所述，GPER的激活可以促进脂肪组织的代谢和能量消耗，从而达到减肥的目的。

（5）GPER激动能减轻OVX小鼠的炎症

体重增加和血脂异常会导致全身炎症和代谢稳态失调。因此接下来评估OVX小鼠系统性炎性细胞因子在近周脂肪组织、肝脏和骨骼肌中的表达情况(TNFα,MCP1和IL6)。我们的结果显示，OVX导致循环肿瘤坏死因子TNFα、MCP1和IL6增加，而在G-1处理后降低。此外，G-1在周环发脂肪、肝脏和骨骼肌中不同程度地降低了炎症标志物mRNA表达的增加。这些结果表明，G-1逆转了OVX小鼠的炎症病理生理表型，可能有助于多种组织代谢功能障碍的正常化。

（6）在OVX小鼠中活化GPER可改善葡萄糖稳态和代谢激素配置

OVX会导致肥胖增加，脂质积累和炎症增加等多种代谢功能障碍，进而导致胰岛素抵抗和糖耐量降低。由于前期结果表明用G-1治疗OVX小鼠可以减少肥胖，因此我们试图确定G-1治疗是否也可以改善葡萄糖稳态。为此，我们进行了葡萄糖耐量试验(GTTs，以评估血液中的葡萄糖清除率)，并将空腹血糖和胰岛素定量作为体内葡萄糖稳态的测量。与对照组小鼠相比，OVX导致了药物处理小鼠的葡萄糖清除延迟。与g-1治疗级,OVX小鼠表现出明显改善葡萄糖间隙。此外,OVX空腹血糖和胰岛素浓度增加,g1治疗导致空腹血糖和胰岛素浓度降低。但G-1治疗除降低胰高血糖素外，OVX和G-1对ghrelin、PYY、GIP、amylin或GLP-1均无影响。这些结果表明，G-1可能具有通过调节葡萄糖稳态和几种代谢激素来调节代谢的多个方面的能力。

（7）G-1在DIO小鼠中减少体重增加和改善葡萄糖稳态

最后为了确定G-1是否在DIO模型中也有效，我们首先用HFD喂养雄性小鼠12周，以诱导肥胖、葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗，然后用G-1喂养小鼠8周。值得注意的是，与经G-1处理后体重随时间下降的OVX雌性小鼠相比，经G-1处理的雄性小鼠阻止了体重进一步增加，而对照组(经药物处理)的雄性小鼠在治疗过程中体重继续增加。在8周的治疗期结束时，与经药物处理的小鼠相比，经g-1处理的雄性小鼠表现出血浆胆固醇降低和能量消耗增加，达到与对照雄性小鼠组相似的水平。在8周的治疗期间，虽然g-1治疗的雄性小鼠没有出现任何整体体重下降，但空腹血糖、胰岛素、HOMA-IR和糖耐量均显著改善。因此，尽管g-1处理的OVX雌性小鼠的葡萄糖稳态改善与体重减轻相关，但在肥胖雄性小鼠中，葡萄糖稳态改善发生在没有整体体重减轻的前提下。由于饮食经常导致绝经后妇女的肥胖和糖尿病，我们进一步扩大了对OVX雌鼠的观察，增加了一种HFD，以确定G-1是否可以减轻雌激素缺乏和HFD的联合有害影响。在这些条件下，G-1处理显著降低了OVX/HFD小鼠的体重，改善了葡萄糖稳态。因此，我们的研究提供了强有力的证据，表明G-1在男性和女性肥胖和糖尿病的多种临床前模型中发挥了抗肥胖和抗糖尿病的作用。

5.结论与创新点：

GPER选择性小分子激动剂G-1有对抗肥胖和代谢功能障碍的临床前活性，表明G-1可能成为抗肥胖和抗糖尿病的潜在靶点。

文章对雌鼠和雄鼠分别进行研究，发现G-1虽然能改善糖代谢及脂代谢等，但不能改变体重，而在雌鼠中既可以显著改善体重，又可以调节糖代谢及脂代谢。说明可能存在性别差异性。

6.DOI:10./scitranslmed.aau

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